體外細胞培養是研究細胞功能、了解**和發現新藥的重要工具。這些實驗中的大部分是在組織培養處理過的塑料器皿中進行2D單層細胞培養。然而，這與活細胞的體內環境看起來完全不同。細胞嵌入由其他細胞和結構組成的組織中，稱為細胞外基質（ECM；圖1A）。細胞對細胞和細胞對ECM的相互作用以及這些組織內的機械力對細胞形態和行為有著至關重要的影響。此外，活體組織中的營養物質、代謝產物、氧氣和CO2暴露于3D細胞結構（例如腫瘤）與2D單層中有非常大的區別的（圖1B和1C）。

圖1A：活體組織中具有細胞間接觸和細胞間ECM接觸的細胞示意圖。

圖1B：3D腫瘤球體的示意圖，外部為增殖細胞，內部為壞死細胞，中間為靜止細胞。外部的氧氣和營養物質濃度很高，而內部的二氧化碳和代謝廢物含量很高。

圖1C：使用ibidi泵系統灌注培養14天后，L929球體在μ-Slide Spheroid Perfusion, Bioinert中的活/死FDA/PI染色，0.75 ml/min。綠色：活細胞（熒光素二乙酸酯，FDA）；紅色：死細胞（碘化丙啶，PI）。寬場熒光顯微鏡，10倍物鏡。

研究人員在建立細胞培養模型以研究細胞功能、特定**(如癌癥)或表征某些**之前，必須考慮這些因素。為了獲得*接近體內的實驗結果，盡可能地模擬活體組織的生理條件也是有意義的。

在本文中，我們引入了不同的三維細胞培養模型來研究細胞在體內的狀態。

從單層細胞到組織：

雖然細胞仍然主要是在細胞培養處理過的塑料表面或包被蛋白質或厚細胞基質(2.5D培養)的2D單層中培養，但當你想用更生理的方式培養細胞時，你可以選擇各種3D細胞培養模型(圖2)。可以使用基于支架的技術，如聚合物或水凝膠，它們通過合成化學聚合物或蛋白質網絡提供結構支持?；蛘撸梢允褂脽o支架技術獲得3D細胞結構，其中復雜的細胞聚集體或整個組織可以在沒有額外結構支持的情況下形成。

圖2: 2D和3D細胞培養模型概述

這兩種方法各有利弊，在決定哪種技術*適合各自的研究問題時，應考慮這些利弊。支架方法考慮了細胞與ECM的相互作用，而懸浮生長的球體可以更好地控制細胞的環境。

為了在顯微鏡上進行3D結構的長期培養和研究，已經開發了特殊的工具和技術，以確保在長時間內持續提供介質并模擬生理條件。

基于支架的3D細胞培養模型：

3D細胞培養模型的支架可以從多孔聚合物膜到模擬ECM細胞微環境的復雜水凝膠。

一般來說，水凝膠形成交聯聚合物的結構，可以吸收和結合大量的水。在4°C或室溫下，混合物為液體，但在37°C時會形成凝膠。這一特性使得液體與細胞混合成為可能，然后在37°孵育時將細胞嵌入3D基質中。這使得細胞能夠保留特定的體內特征，例如細胞ECM相互作用或環境的生理和機械特性。

有不同類型的水凝膠，如Matrigel®或膠原蛋白，它們源自有機來源。也有復雜的合成水凝膠，其優勢是能對其成分（分子、交聯劑等）進行**的控制。這使其能對各個組成部分的影響得出不同的結論。

無支架3D細胞培養模型：

支架獨立方法允許在沒有基質支持的情況下在3D中培養細胞。它們依賴于細胞自組裝成聚集體或球狀體的概率。為了促進這種自組裝過程，人們建立了各種各樣的技術。

圖 3：在μ-Slide 4 Well中培養的纖維蛋白水凝膠中出牙的人腸成纖維細胞和內皮細胞球狀體。內皮細胞用CD31染色(黃色)，成纖維細胞用波形蛋白染色(紅色)，DNA用DAPI染色(青色)。共焦圖像由H. Nogueira Pinto，生物工程3D微環境組，Instituto de Investiga??o e Inova??o em Saúde (i3S), Universidade do Porto, Portugal。

懸滴技術

懸滴技術是生物學中行之有效的方法，已用于許多不同的應用，如觀察整個(微觀)生物體或蛋白質的結晶。它利用重力形成懸浮液滴，懸掛在玻璃板上。在過去的十年中，這項技術已經被改進并適用于3D細胞培養的應用，能夠從細胞懸浮液中形成球狀體，而無需支撐支架(圖4)。如今，專門的懸滴板已在市場上銷售。然而，雖然這種方法適用于球狀體的生成，但不可能將其與高分辨率顯微鏡相結合。

圖 4：懸滴法原理

超低吸附 (ULA) 涂層

所謂的低粘附板是涂有中性電荷或親水性蛋白質或水凝膠，可減少細胞對板表面的附著，從而形成 3D細胞結構。盡管這種涂層主要防止細胞附著，但在更長的時間后，細胞粘附仍可能發生，因為涂層通常只是物理吸附而非共價結合——因此不具有長期穩定性。

生物惰性表面

與標準的ULA涂層相比，生物惰性表面是共價結合的，并提供穩定的表面鈍化。因此，它可以完全防止蛋白質或細胞附著在涂層表面。這促進了細胞間的相互作用和3D細胞聚集的形成，即使是在長期實驗中(圖5)。

圖5: ibidi聚合物蓋玻片生物惰性表面的球狀體形成

微圖案表面微孔板

在Bioinert表面上壓印微圖案可以使細胞**粘附在指定位置（圖6）。

圖6：微圖案點上的細胞附著動態圖

μ-patterned圖案處周圍的鈍化區域有助于形成3D細胞聚集體和球狀體（圖7和8）。

圖7：微圖案點上球體形成的原理

圖8：接種在200 μm粘附點上的NIH-3T3細胞系懸浮液，64小時活細胞成像，相差，4x 物鏡。

具有特殊幾何形狀的微孔板、微流控器官芯片和用于長期3D細胞培養的設備

為了體外細胞培養盡可能接近體內條件，與灌注設備相結合的微流控器官芯片檢測變得越來越重要。在這種應用中，細胞被嵌入到微通道中的基質中。這些通道可以灌注培養基或**，用于在流動或**篩選下進行長期細胞培養（圖9和10）。

具有特殊幾何形狀的微孔板允許進行特定的基于3D細胞的測定（如：傷口**或趨化性測定）或模擬不同的器官（如：肺或肝）。

圖9：ibidi μ-Slide Spheroid Perfusion球體灌注的工作原理，它可連接到泵系統（如ibidi泵系統），用于長期培養球狀體

圖 10：L929 成纖維細胞在 μ-Slide Spheroid Perfusion, Bioinert球體灌注中顯示球狀體形成，，第1-14天，接種濃度5 x 105個單細胞/ml。左圖：無灌注，每隔**更換一次培養基。右圖：使用 ibidi 泵系統灌注，0.75 毫升/分鐘。相差顯微鏡，10 倍物鏡，孔徑 800 μm。

總之，通過從2D細胞單層到3D細胞培養，已經在模擬活體組織的生理條件方面取得了巨大的進展。這可以更好地讀取基于細胞的分析、**模型和**效應，從而使細胞培養總體上更準確，成為動物模型的更好替代品。

ibidi開發用于3D細胞模型分析的產品

有關球體、類器官和3D細胞培養的更多信息，請查看：ibidi 3D細胞(球狀體、類器官和單細胞)培養（←點擊即可查看）。

參考文獻：

Kim W, Gwon Y, Park S, Kim H, Kim J. Therapeutic strategies of three-dimensional stem cell spheroids and organoids for tissue repair and regeneration. Bioact Mater. 2022 Apr 4;19:50-74. doi: 10.1016/j.bioactmat.2022.03.039.

Krysko DV, Demuynck R, Efimova I, Naessens F, Krysko O, Catanzaro E. In Vitro Veritas: From 2D Cultures to Organ-on-a-Chip Models to Study Immunogenic Cell Death in the Tumor Microenvironment. Cells. 2022 Nov 21;11(22):3705. doi: 10.3390/cells11223705.

Langhans SA. Three-Dimensional in Vitro Cell Culture Models in Drug Discovery and Drug Repositioning. Front Pharmacol. 2018 Jan 23;9:6. doi: 10.3389/fphar.2018.00006.

Clevers H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 2016 Jun 16;165(7):1586-1597. doi: 10.1016/j.cell.2016.05.082.