μ-Slide 8 Wellhigh（貨號：80806）8孔高壁進行**熒光染色

**熒光(IF)是使用顯微鏡深入了解細胞結構和過程的有效方法。此方法可評估特定蛋白質的表達和位置，使得**熒光成為科學家解決許多細胞生物學問題不可或缺的工具。

下面我們將介紹一種在ibidi μ-Slide 8 Well high 八孔高壁載玻片中培養和**熒光染色的貼壁人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的一體化簡單便捷的方法：

請注意：在開始細胞**熒光實驗之前，需要檢查幾個重要參數，例如目標蛋白質的表達水平、*佳細胞密度以及理想的培養細胞的耗材和基質/涂層。還應評估*佳抗體稀釋度。此外，陽性和陰性對照是驗證**熒光染色的必要條件。因此，我們強烈建議在實驗前進行**的文獻研究。

1. 材料

1.1. 試劑和緩沖液：

? 人臍靜脈內皮細胞（HUVEC、C-12203、Promocell）

? 膠原蛋白 IV（354233，Corning）

? 0.05M HCl (X942.1, Carl Roth)

? 細胞培養基：內皮細胞基礎培養基（C-22210，Promocell）和內皮細胞生長培養基補充混合物（C-39215，Promocell）

? PBS（14190144，Gibco）

? Accutase（A1110501，Gibco）

**熒光染色：

?  PBS（14190144，Gibco）

? 福爾馬林，10%，即用型（HT5011，Sigma Aldrich）

? 單克隆抗 α-微管蛋白（T5168，Sigma Aldrich）

? 抗小鼠 IgG-Atto 594 (76085 Sigma Aldrich)

? 鬼筆環肽 488 偶聯物（ab176753，Abcam）

? 使用DAPI 的ibidi 抗熒光淬滅劑（50011，ibidi）

? Triton-X-100（A16046，Thermo Fisher Scientific）

? 穿透緩沖液（PBS 中0.5% Triton-X-100）

? 封閉緩沖液（PBS 中1% BSA + 0.2% Triton X 100）

? 抗體稀釋緩沖液（1% BSA + 0.05% Triton X 100 的PBS 溶液）

? 牛血清白蛋白 (BSA) (A1470-10G, Sigma Aldrich)

? ibidi浸油（50101，ibidi）

1.2. 設備：

80806八孔高壁

μ-載玻片架（80003）

? μ-Slide 8 Well high 8孔高壁腔室載玻片，ibiTreat（80806，ibidi）

? μ-載玻片架（80003，ibidi）

? 標準細胞培養設備（移液器、無菌工作臺、細胞培養箱、培養瓶、細胞培養基、血細胞計數器等）

? 帶有適當濾光片組的倒置熒光顯微鏡

2. 方法

2.1. 細胞培養：

使用前μ-Slide 8孔高壁腔室載玻片前，請閱讀說明書。在無菌條件下執行所有步驟。實驗開始前，在標準細胞培養瓶中制備 HUVEC(如T75，用0.05 M HCl包被6.7μg/ml IV膠原蛋白1 小時)，細胞貼壁。實驗當天細胞應該是健康的并且處于*佳匯合狀態。

在整個過程中快速工作很重要，這樣孔中才不會干涸。

如果未另行說明，則所有給定的體積都為每孔的體積，所有的孵育步驟都是在室溫下進行的。

? 用Accutase處理培養的HUVEC 1-2分鐘以進行分離。

? 收集細胞懸液，離心，用少量培養基稀釋后進行計數；量取決于所需的細胞濃度。

? 計數細胞，在內皮細胞基礎培養基和內皮細胞生長培養基補充混合物中，并調整到*終濃度為 2 x 105cells/ml 。

? 打開 ibidi μ-Slide 8 Well高壁的包裝并將其放在μ- Slide Rack或適當的表面上。

? 在每個孔中加入250μl的HUVEC懸浮液。

? 蓋上隨附的蓋子。

? 將載玻片與支架一起放入培養箱（37°C，5% CO2）中，讓細胞附著至少3小時或過夜。

? 對于延長細胞培養，我們建議每隔**更換一次培養基。

2.2. 固定、透化和封閉：

? 為您的實驗準備足夠的穿透緩沖液和封閉緩沖液。

? 使用細胞培養吸液裝置從孔中吸出細胞培養基。

? 用PBS清洗細胞：將200 μl PBS緩慢加入每個孔中并吸出。

? 用200μl福爾馬林 (10%) 固定細胞10分鐘。

? 去除福爾馬林并用200μl PBS洗滌細胞3次。

? 將細胞在200μl穿透緩沖液中孵育10分鐘。

? 去除穿透緩沖液并用200μL PBS清洗細胞。

? 用200μl封閉緩沖液封閉30分鐘。

2.3.染色和封片：

? 在封閉步驟中，準備足夠的抗體稀釋緩沖液來稀釋一抗和二抗。

? 在抗體稀釋緩沖液中稀釋一抗（α-微管蛋白：1:200稀釋）。

? 將細胞在150μl一抗溶液中孵育 2 小時（請注意，許多抗體需要在4°C下過夜孵育）。

? 用200μl Blocking Buffer清洗兩次。

? 在相同的抗體稀釋緩沖液中稀釋二抗和鬼筆環肽（anti-mouse-IgGAtto 594：1:200 稀釋度；鬼筆環肽488偶聯物1:1000 稀釋度）。

? 在黑暗中將細胞在150 μl的二抗溶液中孵育 2 小時。從此時起，樣品應盡可能保存在黑暗中

? 用200 μl Blocking Buffer清洗兩次

? 清空所有孔。

? 每孔加入一滴含有DAPI的ibidi封固劑。

? 儲存在4°C的黑暗中，直到成像。*好立即進行成像，因為較長的存儲期可能會降低圖像質量。

2.4.成像：

? 使用適當的濾光片組在熒光顯微鏡下觀察細胞，必要時使用ibidi 浸油。

? 可選，覆蓋圖像以創建合并圖像。

3. 結果

HUVEC 在μ-Slide 8孔高壁腔室載玻片中**染色 ，寬視場熒光顯微鏡。F-肌動蛋白細胞骨架被鬼筆環肽（紅色）染色。α-微管蛋白抗體用于染色微管（綠色）。用 DAPI（藍色）可視化細胞核。該圖像是在尼康顯微鏡上使用具有油浸的 60 倍物鏡拍攝的。

如果您的**熒光(IF)染色未達到預期效果，您可以在這里（**熒光染色故障排除指南）里找到故障排除提示！